ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ RNA (dsRNA) ELISA KIT

આ કિટ એ એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે (ELISA) બાયોટિન-સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન સિસ્ટમ સાથે જોડાણ છે, 60 બેઝ પેર(bp) થી વધુ લંબાઈ સાથે dsRNA ના જથ્થાત્મક માપન માટે, અનુક્રમને ધ્યાનમાં લીધા વગર.પ્લેટને એન્ટિ-ડીએસઆરએનએ એન્ટિબોડી સાથે પ્રી-કોટેડ કરવામાં આવી છે.નમૂનામાં હાજર dsRNA ઉમેરવામાં આવે છે અને કુવાઓ પર કોટેડ એન્ટિબોડીઝ સાથે જોડાય છે.અને પછી બાયોટિનીલેટેડ એન્ટિ-dsRNA એન્ટિબોડી ઉમેરવામાં આવે છે અને નમૂનામાં dsRNA સાથે જોડાય છે.ધોવા પછી, એચઆરપી-સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન ઉમેરવામાં આવે છે અને બાયોટિનિલેટેડ એન્ટિ-ડીએસઆરએનએ એન્ટિબોડી સાથે જોડાય છે.ઇન્ક્યુબેશન પછી અનબાઉન્ડ એચઆરપી-સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન ધોવાઇ જાય છે.ત્યારબાદ TMB સબસ્ટ્રેટ સોલ્યુશન HRP દ્વારા ઉમેરવામાં આવે છે અને તેને ઉત્પ્રેરિત કરીને વાદળી રંગનું ઉત્પાદન બનાવવામાં આવે છે જે એસિડિક સ્ટોપ સોલ્યુશન ઉમેર્યા પછી પીળા રંગમાં બદલાઈ જાય છે.પીળા રંગની ઘનતા પ્લેટમાં કેપ્ચર કરાયેલ dsRNA ની લક્ષિત રકમના પ્રમાણસર છે.શોષણ 450 એનએમ પર માપવામાં આવે છે.

અરજી

આ કિટ શેષ dsRNA ના માત્રાત્મક માપન માટે છે.

કીટ ઘટકો

સંગ્રહ અને સ્થિરતા

1. ન વપરાયેલ કીટ માટે: આખી કીટ શેલ્ફ લાઇફમાં 2~8℃ પર સ્ટોર કરી શકાય છે.સંગ્રહ સ્થિરતા માટે મજબૂત પ્રકાશ ટાળવો જોઈએ.

2. વપરાયેલી કીટ માટે: એકવાર માઇક્રોપ્લેટ ખોલી દેવામાં આવે, કૃપા કરીને ન વપરાયેલ કૂવાઓને પ્લેટ સીલરથી આવરી લો અને ડેસીકન્ટ પેક ધરાવતા ફોઇલ પાઉચ પર પાછા ફરો, ફોઇલ પાઉચને ઝિપ-સીલ કરો અને ઉપયોગ કર્યા પછી શક્ય તેટલી વહેલી તકે 2~8℃ પર પાછા ફરો.અન્ય રીએજન્ટ્સ ઉપયોગ કર્યા પછી શક્ય તેટલી વહેલી તકે 2~8℃ પર પાછા ફરવા જોઈએ.

સામગ્રી જરૂરી છે પરંતુ પૂરી પાડવામાં આવતી નથી

1. 450±10nm ફિલ્ટર સાથે માઇક્રોપ્લેટ રીડર (450 અને 650 nm તરંગલંબાઇ પર શોધી શકાય તો વધુ સારું).

2. માઇક્રોપ્લેટ શેકર.

3. RNase-મુક્ત ટીપ્સ અને સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબ.

ઓપરેશન ફ્લોચાર્ટ

તમે ચાલુ કરો તે પહેલા

1. ઉપયોગ કરતા પહેલા કીટના તમામ ઘટકો અને નમૂનાઓને ઓરડાના તાપમાને (18-25℃) પર લાવો.જો કીટનો ઉપયોગ એક જ સમયે કરવામાં આવશે નહીં, તો કૃપા કરીને વર્તમાન પ્રયોગ માટે ફક્ત સ્ટ્રીપ્સ અને રીએજન્ટ્સ લો અને બાકીની સ્ટ્રીપ્સ અને રીએજન્ટ્સને જરૂરી સ્થિતિમાં છોડી દો.

2. વૉશ બફર: 1× વૉશ બફરનું 800mL તૈયાર કરવા માટે 20× સંકેન્દ્રિત વૉશ બફરના 40mL ને 760mL ડિયોનાઇઝ્ડ અથવા ડિસ્ટિલ્ડ વોટર સાથે પાતળું કરો.

3. ધોરણ: ઉપયોગ કરતા પહેલા સ્ટોક સોલ્યુશનને થોડા સમય માટે સ્પિન કરો અથવા સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો.પૂરા પાડવામાં આવેલ ચાર ધોરણોની સાંદ્રતા 5ng/μL છે.UTP અને pUTP dsRNA ધોરણો માટે, પ્રમાણભૂત વળાંક દોરવા માટે કૃપા કરીને STE બફર સાથે સ્ટોક સોલ્યુશનને 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL સુધી પાતળું કરો.N1-Me-pUTP dsRNA ધોરણો માટે, પ્રમાણભૂત વળાંક દોરવા માટે કૃપા કરીને સ્ટોક સોલ્યુશનને 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL STE બફર સાથે પાતળું કરો.5-OMe-UTP dsRNA સ્ટાન્ડર્ડ માટે, પ્રમાણભૂત વળાંક દોરવા માટે કૃપા કરીને સ્ટોક સોલ્યુશનને 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL STE બફર સાથે પાતળું કરો.અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે ધોરણોને નીચેના ચાર્ટ તરીકે પાતળું કરી શકાય:

4. બાયોટિનીલેટેડ ડિટેક્શન એન્ટિબોડી અને એચઆરપી-સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન વર્કિંગ સોલ્યુશન: ઉપયોગ કરતા પહેલા સ્ટોક સોલ્યુશનને થોડા સમય માટે સ્પિન અથવા સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો.મંદન બફર સાથે તેમને કાર્યકારી સાંદ્રતામાં પાતળું કરો.

5. TMB સબસ્ટેટ: વંધ્યીકૃત ટીપ્સ સાથે દ્રાવણની જરૂરી માત્રાને એસ્પિરેટ કરો અને શેષ દ્રાવણને ફરીથી શીશીમાં નાખશો નહીં.TMB સબસ્ટેટ પ્રકાશ પ્રત્યે સંવેદનશીલ હોય છે, TMB સબસ્ટ્રેટને લાંબા સમય સુધી પ્રકાશમાં ન રાખો.

પ્રોટોકોલનો ઉપયોગ કરીને

1. પરીક્ષા માટે જરૂરી સ્ટ્રીપ્સની સંખ્યા નક્કી કરો.ઉપયોગ માટે ફ્રેમમાં સ્ટ્રીપ્સ દાખલ કરો.બાકીની પ્લેટ સ્ટ્રીપ્સ જે આ અભ્યાસમાં ઉપયોગમાં લેવામાં આવી નથી તે ડેસીકન્ટ સાથે બેગમાં ફરીથી પેક કરવી જોઈએ.રેફ્રિજરેટેડ સ્ટોરેજ માટે બેગને ચુસ્તપણે બંધ કરો.

2. યોગ્ય કુવાઓમાં પ્રમાણભૂત, ખાલી અને નમૂનાઓના દરેક 100μL ઉમેરો.પ્લેટ સીલર સાથે આવરી.ઓરડાના તાપમાને 500rpm પર ધ્રુજારી સાથે 1 કલાક માટે સેવન કરો.સચોટ પરીક્ષા માટે નમૂનાઓને યોગ્ય સાંદ્રતા માટે STE બફરથી પાતળું કરવું જોઈએ.

3. ધોવાનું પગલું: સોલ્યુશનને એસ્પિરેટ કરો અને દરેક કૂવામાં 250μL વૉશ બફર વડે ધોઈ લો અને તેને 30 સેકન્ડ સુધી રહેવા દો.પ્લેટને શોષક કાગળ પર સ્નેપ કરીને વૉશ બફરને સંપૂર્ણપણે કાઢી નાખો.સંપૂર્ણપણે 4 વખત ધોવા.

4. દરેક કૂવામાં 100μL બાયોટીનીલેટેડ ડિટેક્શન એન્ટિબોડી વર્કિંગ સોલ્યુશન ઉમેરો.પ્લેટ સીલર સાથે આવરી.ઓરડાના તાપમાને 500rpm પર ધ્રુજારી સાથે 1 કલાક માટે સેવન કરો.

5. ધોવાનું પગલું પુનરાવર્તિત કરો.

6. દરેક કૂવામાં 100μL HRP-સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન વર્કિંગ સોલ્યુશન ઉમેરો.પ્લેટ સીલર સાથે આવરી.ઓરડાના તાપમાને 500rpm પર ધ્રુજારી સાથે 30 મિનિટ માટે સેવન કરો.

7. ફરીથી ધોવાનું પગલું પુનરાવર્તન કરો.

8. દરેક કૂવામાં TMB સબસ્ટ્રેટ સોલ્યુશનનું 100μL ઉમેરો.પ્લેટ સીલર સાથે આવરી.આરટી પ્રોટેક્ટ પર 30 મિનિટ માટે લાઇટથી સેવન કરો.સબસ્ટ્રેટ સોલ્યુશન ઉમેરવાથી પ્રવાહી વાદળી થઈ જશે.

9. દરેક કૂવામાં 50μL સ્ટોપ સોલ્યુશન ઉમેરો.સ્ટોપ સોલ્યુશન ઉમેરવાથી પ્રવાહી પીળો થઈ જશે.પછી માઇક્રોપ્લેટ રીડર ચલાવો અને તરત જ 450nm પર માપન કરો.

પરિણામોની ગણતરી

1. દરેક ધોરણ, નિયંત્રણ અને નમૂનાઓ માટે સરેરાશ ડુપ્લિકેટ રીડિંગ્સ અને સરેરાશ શૂન્ય પ્રમાણભૂત ઓપ્ટિકલ ઘનતાને બાદ કરો.વર્ટિકલ (Y) અક્ષ પર શોષકતા અને આડી (X) અક્ષ પર dsRNA સાંદ્રતા સાથે પ્રમાણભૂત વળાંક બનાવો.

2. કર્વ એક્સપર્ટ 1.3 અથવા ELISA Calc જેવા 5 અથવા 4 પેરામીટર નોન-લીનીયર ફીટ મોડેલમાં કોમ્પ્યુટર આધારિત કર્વ-ફીટીંગ સોફ્ટવેર સાથે ગણતરી કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.

પ્રદર્શન

1. સંવેદનશીલતા:

તપાસની નીચી મર્યાદા: ≤ 0.001pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA માટે), ≤ 0.01pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA માટે).

પરિમાણની નીચી મર્યાદા: 0.0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA માટે), 0.0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA માટે), 0.0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA માટે).

2. પ્રિસિઝન: ઈન્ટ્રા-એસે ≤10% નું સીવી, ઈન્ટર-એસેનું સીવી ≤10%

3. પુનઃપ્રાપ્તિ: 80% ~ 120%

4.રેખીયતા:0.0156-0.5pg/μL(UTP-,pUTP-dsRNA માટે)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA), 0.0625-1pg/μL(5-OMe-UTP-dsRNA માટે).

વિચારણાઓ

1. TMB પ્રતિક્રિયા તાપમાન અને સમય નિર્ણાયક છે, કૃપા કરીને સૂચના અનુસાર તેમને સખત રીતે નિયંત્રિત કરો.

2. સારી એસે પુનઃઉત્પાદનક્ષમતા અને સંવેદનશીલતા હાંસલ કરવા માટે, વધારાની બિન-પ્રતિક્રિયાવાળા રીએજન્ટ્સને દૂર કરવા માટે પ્લેટોને યોગ્ય રીતે ધોવા જરૂરી છે.

3. ઉપયોગ કરતા પહેલા તમામ રીએજન્ટને સારી રીતે મિશ્રિત કરવા જોઈએ અને નમૂના અથવા રીએજન્ટ ઉમેરતી વખતે બમ્બલ્સ ટાળવા જોઈએ.

4. જો સંકેન્દ્રિત વૉશ બફર(20x)માં સ્ફટિકો બને છે, તો 37℃ સુધી ગરમ કરો અને જ્યાં સુધી સ્ફટિકો સંપૂર્ણપણે ઓગળી ન જાય ત્યાં સુધી હળવા હાથે મિક્સ કરો.

5. સોડિયમ એઝાઇડ (NaN3) ધરાવતા નમૂનાઓની તપાસ ટાળો, કારણ કે તે HRP પ્રવૃત્તિને નષ્ટ કરી શકે છે જેના પરિણામે dsRNA ની માત્રા ઓછી થઈ જાય છે.

6. પરીક્ષા દરમિયાન RNase દૂષણ ટાળો.

7. પ્રમાણભૂત/નમૂનો, શોધ એન્ટિબોડી અને SA-HRP પણ RT પર ધ્રુજારી વિના હાથ ધરવામાં આવી શકે છે, પરંતુ આ શોધ સંવેદનશીલતામાં એક ગણો ઘટાડો લાવી શકે છે.આ કિસ્સામાં, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે UTP અને pUTP dsRNA ધોરણોને 2pg/μL થી પાતળું કરવા જોઈએ, N1-Me-pUTP dsRNA ધોરણોને 4pg/μL અને 5-OMe-UTP dsRNA ધોરણોને 8pg/μL થી પાતળું કરવા જોઈએ.વધુમાં, HRP-સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન કાર્યકારી સોલ્યુશનને ઓરડાના તાપમાને 60 મિનિટ માટે ઉકાળો.ફ્લાસ્ક શેકરનો ઉપયોગ કરશો નહીં, કારણ કે ફ્લાસ્ક શેકર અચોક્કસ પરિણામમાં પરિણમી શકે છે.

લાક્ષણિક પરિણામ

1. માનક વળાંક ડેટા

2. પ્રમાણભૂત વળાંકની ગણતરી

3. લાઇનર શોધ શ્રેણી: 0.0312- 1pg/μL