mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase એ રિકોમ્બિનન્ટ E. coli સ્ટ્રેઈનમાંથી ઉતરી આવ્યું હતું જે રસી mRNA Cap 2 ´-O-મેથાઈલટ્રાન્સફેરેસ માટે જનીન વહન કરે છે.આ એન્ઝાઇમ આરએનએના 5´એન્ડ પર કેપ સ્ટ્રક્ચરને અડીને આવેલા પ્રથમ ન્યુક્લિયોટાઇડના 2´-O સ્થાને મિથાઈલ જૂથ ઉમેરે છે. એન્ઝાઇમ મેથાઈલ કેપ્ડ RNA (કેપ) માટે મિથાઈલ દાતા તરીકે S-adenosylmethionine (SAM) નો ઉપયોગ કરે છે. -0) કેપ-1 સ્ટ્રક્ચરમાં પરિણમે છે.

Cap1 માળખું ટ્રાન્સફેક્શન અને માઇક્રોઇંજેક્શન પ્રયોગોમાં mRNA ની અભિવ્યક્તિમાં સુધારો કરીને અનુવાદ કાર્યક્ષમતામાં વધારો કરી શકે છે. આ એન્ઝાઇમને ખાસ કરીને સબસ્ટ્રેટ તરીકે m7GpppN કેપ સાથે RNAની જરૂર છે.તે 5´ છેડે pN, ppN, pppN અથવા GpppN સાથે RNA નો ઉપયોગ કરી શકતું નથી.કેપ્ડ આરએનએ કેપ એનાલોગનો ઉપયોગ કરીને ઇન વિટ્રો ટ્રાન્સક્રિપ્શન દ્વારા અથવા વેક્સિનિયા કેપિંગ એન્ઝાઇમનો ઉપયોગ કરીને એન્ઝાઇમેટિક કેપિંગ દ્વારા તૈયાર કરી શકાય છે.

ઘટકો

mRNA કેપ 2´-ઓ-મેથિલટ્રાન્સફેરેસ (50U/μL)

10×કેપિંગ રિએક્શન બફર

સંગ્રહ

સ્ટોરેજ માટે -25 ～- 15℃ （પુનરાવર્તિત ફ્રીઝ-થૉ ચક્ર ટાળો）

સંગ્રહ બફર

20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% ટ્રાઇટોન X- 100, 50% ગ્લિસરોલ.

એકમની વ્યાખ્યા

એક એકમને 37°C તાપમાને 1 કલાકમાં 80 nt કેપ્ડ RNA ટ્રાન્સક્રિપ્ટના 10 pmoles મેથાઈલ કરવા માટે જરૂરી એન્ઝાઇમની માત્રા તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવે છે.

ગુણવત્તા નિયંત્રણ પરીક્ષણો

એક્સોનોક્લીઝ1μg λ-હિન્દ III ડાયજેસ્ટ ડીએનએ સાથે 37 ℃ પર 16 કલાક માટે mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase નું :50U એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નિર્ધારિત કોઈપણ અધોગતિ પેદા કરતું નથી.

એન્ડોન્યુક્લીઝ: 16 કલાક માટે 37℃ પર 1 μg λDNA સાથે mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ના 50 U એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નિર્ધારિત કર્યા મુજબ કોઈ અધોગતિ પેદા કરતું નથી.

નિકાસે: 16 કલાક માટે 37 ℃ પર 1μg pBR322 સાથે mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase નું 50U એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નિર્ધારિત કોઈપણ અધોગતિ પેદા કરતું નથી.

RNase: 37℃ પર 4 કલાક માટે 1.6μg MS2 RNA સાથે mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase નું 50U એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નિર્ધારિત કોઈ અધોગતિ પેદા કરતું નથી.

E. કોલી ડીએનએ: mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ની હાજરી માટે 50U ની તપાસ કરવામાં આવે છે.E. કોલી માટે વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સ સાથે TaqMan qPCR નો ઉપયોગ કરીને જીનોમિક ડીએનએE. કોલી 16S rRNA લોકસ.આE. કોલી જીનોમિક DNA દૂષણ =1 છેE. કોલી જીનોમ

બેક્ટેરિયલ એન્ડોટોક્સિન: LAL-પરીક્ષણ, ચાઇનીઝ ફાર્માકોપીયા IV 2020 આવૃત્તિ અનુસાર, જેલ મર્યાદા પરીક્ષણ પદ્ધતિ, સામાન્ય નિયમ (1143).બેક્ટેરિયલ એન્ડોટોક્સિન સામગ્રી = 10 EU/mg હોવી જોઈએ.

પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમ અને શરતો

1. 1.5 mL માઇક્રોફ્યુજ ટ્યુબમાં કેપ્ડ RNA અને RNase-ફ્રી H2O ની યોગ્ય માત્રાને 16.0 μL ના અંતિમ વોલ્યુમમાં ભેગું કરો.

2. 5 મિનિટ માટે 65℃ પર ગરમ કરો અને ત્યારબાદ 5 મિનિટ માટે આઇસ-બાથ કરો.

3. નીચેના ઘટકોને ઉલ્લેખિત ક્રમમાં ઉમેરો (કેપ્ડ RNA ના મેથિલેશન માટે

10 કરતા ઓછા

*10× કેપિંગ રિએક્શન બફર : 500 mM Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT.

4. 1 કલાક માટે 37℃ પર ઉકાળો (200 nt કરતા ઓછા લક્ષ્ય ટુકડા માટે 2 કલાકના સેવનની ભલામણ કરવામાં આવે છે).

અરજીઓ

માઇક્રોઇંજેક્શન અને ટ્રાન્સફેક્શન પ્રયોગો દરમિયાન mRNA અભિવ્યક્તિને સુધારવા માટે.

ઉપયોગ પર નોંધો

1. પ્રતિક્રિયા પહેલાં, આરએનએ શુદ્ધ કરવું જોઈએ અને ન્યુક્લિઝ-મુક્ત પાણીમાં ઓગળવું જોઈએ, બધા ઉકેલોમાં કોઈપણ EDTA અને આયનો ન હોવા જોઈએ.

2. પ્રતિલિપિના 5'એન્ડ પર ગૌણ માળખું દૂર કરવા માટે પ્રતિક્રિયા પહેલાં 5 મિનિટ માટે નમૂના RNA ને 65℃ પર ગરમ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.જટિલ 5 ´ -ટર્મિનલ સ્ટ્રક્ચર માટે તેને 10 મિનિટ સુધી લંબાવી શકાય છે.