PNGase F
પેપ્ટાઇડ-એન-ગ્લાયકોસિડેઝ એફ(PNGase F) એ ગ્લાયકોપ્રોટીનમાંથી લગભગ તમામ એન-લિંક્ડ ઓલિગોસેકરાઇડ્સને દૂર કરવા માટે સૌથી અસરકારક એન્ઝાઇમેટિક પદ્ધતિ છે.PNGase F એ એમિડેઝ છે, જે એન-લિંક્ડ ગ્લાયકોપ્રોટીનમાંથી ઉચ્ચ મેનોઝ, હાઇબ્રિડ અને જટિલ ઓલિગોસેકરાઇડ્સના આંતરિક સૌથી GlcNAc અને શતાવરીના અવશેષો વચ્ચે ફાટી જાય છે.
અરજી
આ એન્ઝાઇમ પ્રોટીનમાંથી કાર્બોહાઇડ્રેટના અવશેષોને દૂર કરવા માટે ઉપયોગી છે.
તૈયારી અને સ્પષ્ટીકરણ
| દેખાવ | રંગહીન પ્રવાહી |
| પ્રોટીન શુદ્ધતા | ≥95% (SDS-PAGE માંથી) |
| પ્રવૃત્તિ | ≥500,000 U/mL |
| એક્સોગ્લાયકોસિડેઝ | કોઈ પ્રવૃત્તિ શોધી શકાઈ નથી (ND) |
| એન્ડોગ્લાયકોસિડેઝ F1 | ND |
| એન્ડોગ્લાયકોસિડેઝ F2 | ND |
| એન્ડોગ્લાયકોસિડેઝ F3 | ND |
| એન્ડોગ્લાયકોસિડેઝ એચ | ND |
| પ્રોટીઝ | ND |
ગુણધર્મો
| EC નંબર | 3.5.1.52(સૂક્ષ્મજીવોમાંથી પુનઃસંયોજક) |
| મોલેક્યુલર વજન | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| આઇસોઇલેક્ટ્રિક પોઇન્ટ | 8. 14 |
| શ્રેષ્ઠ પીએચ | 7.0-8.0 |
| શ્રેષ્ઠ તાપમાન | 65 °સે |
| સબસ્ટ્રેટ વિશિષ્ટતા | GlcNAc અને શતાવરીનો છોડ અવશેષો વચ્ચેના ગ્લાયકોસિડિક બોન્ડને સાફ કરવું Fig.1 |
| માન્યતા સાઇટ્સ | એન-લિંક્ડ ગ્લાયકેન્સ સિવાય કે તેમાં α1-3 ફ્યુકોઝ ફિગ. 2 હોય |
| એક્ટિવેટર્સ | ડીટીટી |
| અવરોધક | એસડીએસ |
| સંગ્રહ તાપમાન | -25 ~-15 ℃ |
| ગરમી નિષ્ક્રિયતા | 1µL PNGase F ધરાવતું 20µL પ્રતિક્રિયા મિશ્રણ 75 °C પર 10 મિનિટ માટે ઉકાળવાથી નિષ્ક્રિય થઈ જાય છે. |
ફિગ. 1 PNGase F ની સબસ્ટ્રેટ વિશિષ્ટતા
ફિગ. 2 PNGase F ની ઓળખાણ બેસે છે.
જ્યારે આંતરિક GlcNAc અવશેષો α1-3 ફ્યુકોઝ સાથે જોડાયેલા હોય છે, ત્યારે PNGase F ગ્લાયકોપ્રોટીનમાંથી N-લિંક્ડ ઓલિગોસેકરાઇડ્સને તોડી શકતું નથી.આ ફેરફાર છોડ અને કેટલાક જંતુઓ ગ્લાયકોપ્રોટીનમાં સામાન્ય છે.
Cઘટકો
|
| ઘટકો | એકાગ્રતા |
| 1 | PNGase F | 50 μl |
| 2 | 10×ગ્લાયકોપ્રોટીન ડિનેચરિંગ બફર | 1000 μl |
| 3 | 10×ગ્લાયકોબફર 2 | 1000 μl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 μl |
એકમની વ્યાખ્યા
એક એકમ(U) એ 10 μL ની કુલ પ્રતિક્રિયાના જથ્થામાં 37°C પર 1 કલાકમાં 10 µg વિકૃત RNase Bમાંથી કાર્બોહાઇડ્રેટના >95% દૂર કરવા માટે જરૂરી એન્ઝાઇમની માત્રા તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવે છે.
પ્રતિક્રિયા શરતો
1. ડીયોનાઇઝ્ડ પાણી સાથે 1-20 µg ગ્લાયકોપ્રોટીન ઓગાળો, 10 µl કુલ પ્રતિક્રિયા વોલ્યુમ બનાવવા માટે 1 µl 10×ગ્લાયકોપ્રોટીન ડિનેચરિંગ બફર અને H2O (જો જરૂરી હોય તો) ઉમેરો.
2.100 °C પર 10 મિનિટ માટે ઉકાળો, તેને બરફ પર ઠંડુ કરો.
3.2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 ઉમેરો અને મિક્સ કરો.
4.1-2 µl PNGase F અને H ઉમેરો2O (જો જરૂરી હોય તો) 20 μl કુલ પ્રતિક્રિયા વોલ્યુમ બનાવવા અને મિશ્રણ.
5.60 મિનિટ માટે 37°C પર પ્રતિક્રિયા ઉકાળો.
6.SDS-PAGE વિશ્લેષણ અથવા HPLC વિશ્લેષણ માટે.
