વેક્સિનિયા વાયરસ કેપિંગ એન્ઝાઇમ
વેક્સિનિયા વાયરસ કેપિંગ એન્ઝાઇમ રિકોમ્બિનન્ટ ઇ. કોલી સ્ટ્રેઇનમાંથી લેવામાં આવ્યો છે જે વેક્સિનિયા કેપિંગ એન્ઝાઇમ માટે જનીનો વહન કરે છે.આ સિંગલ એન્ઝાઇમ બે સબ્યુનિટ્સ (D1 અને D12) થી બનેલું છે અને તેમાં ત્રણ એન્ઝાઇમેટિક પ્રવૃત્તિઓ છે (D1 સબ્યુનિટ દ્વારા આરએનએ ટ્રાઇફોસ્ફેટેઝ અને ગ્વાનિલટ્રાન્સફેરેઝ અને D12 સબ્યુનિટ દ્વારા ગુઆનાઇન મેથાઈલટ્રાન્સફેરેસ).વેક્સિનિયા વાયરસ કેપિંગ એન્ઝાઇમ કેપ સ્ટ્રક્ચરની રચનાને ઉત્પ્રેરિત કરવા માટે અસરકારક છે, જે આરએનએના 5′ છેડે 7-મેથાઈલગુઆનાલેટ કેપ સ્ટ્રક્ચર (m7Gppp, Cap 0) ને ખાસ રીતે જોડી શકે છે.કેપ સ્ટ્રક્ચર (કેપ 0) યુકેરીયોટ્સમાં mRNA સ્થિરીકરણ, પરિવહન અને અનુવાદમાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે.એન્ઝાઇમેટિક પ્રતિક્રિયા દ્વારા આરએનએને કેપિંગ કરવું એ એક અસરકારક અને સરળ પદ્ધતિ છે જે ઇન વિટ્રો ટ્રાન્સક્રિપ્શન, ટ્રાન્સફેક્શન અને માઇક્રોઇન્જેક્શન માટે આરએનએની સ્થિરતા અને અનુવાદને નોંધપાત્ર રીતે સુધારી શકે છે.
ઘટકો
વેક્સિનિયા વાયરસ કેપિંગ એન્ઝાઇમ (10 U/μL)
10×કેપિંગ બફર
સંગ્રહ શરતો
-25～- સંગ્રહ માટે 15℃ (પુનરાવર્તિત ફ્રીઝ-થો સાયકલ ટાળો)
સંગ્રહ બફર
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,
1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% ટ્રાઇટોન X- 100, 50% ગ્લિસરોલ.
એકમ વ્યાખ્યા
Vaccinia વાયરસ કેપીંગ એન્ઝાઇમના એક એકમને 37°C પર 1 કલાકમાં GTP ના 10pmol ને 80nt ટ્રાન્સક્રિપ્ટમાં સામેલ કરવા માટે જરૂરી એન્ઝાઇમની માત્રા તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવે છે.
ગુણવત્તા નિયંત્રણ
એક્સોનોક્લીઝ:1μg λ-Hind III ડાયજેસ્ટ ડીએનએ સાથે 37 ℃ પર 16 કલાક માટે વૅક્સિનિયા વાયરસ કેપિંગ એન્ઝાઇમનું 10U એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નિર્ધારિત કોઈપણ અધોગતિ પેદા કરતું નથી.
એન્ડોન્યુક્લીઝ:16 કલાક માટે 37℃ પર 1μg λDNA સાથે વેક્સિનિયા વાયરસ કેપિંગ એન્ઝાઇમનું 10U એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નિર્ધારિત કોઈ અધોગતિ પેદા કરતું નથી.
નિકાસ:16 કલાક માટે 37 ℃ પર 1 μg pBR322 સાથે Vaccinia વાયરસ કેપિંગ એન્ઝાઇમનું 10U એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નિર્ધારિત કોઈ અધોગતિ પેદા કરતું નથી.
RNase:37℃ પર 4 કલાક માટે 1.6μg MS2 RNA સાથે વેક્સિનિયા વાયરસ કેપિંગ એન્ઝાઇમનું 10U એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નિર્ધારિત કર્યા મુજબ કોઈ અધોગતિ પેદા કરતું નથી.
1.કોલી ડીએનએ:E. coli 16S rRNA લોકસ માટે વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સ સાથે TaqMan qPCR નો ઉપયોગ કરીને E. coli જિનોમિક ડીએનએની હાજરી માટે વેક્સિનિયા વાયરસ કેપિંગ એન્ઝાઇમનું 10U તપાસવામાં આવે છે.ઇ. કોલી જીનોમિક ડીએનએ દૂષણ એ≤1 ઇ. કોલી જીનોમ છે.
2.બેક્ટેરિયલ એન્ડોટોક્સિન: LAL-પરીક્ષણ, ચાઇનીઝ ફાર્માકોપીયા IV 2020 આવૃત્તિ અનુસાર, જેલ મર્યાદા પરીક્ષણ પદ્ધતિ, સામાન્ય નિયમ (1143).બેક્ટેરિયલ એન્ડોટોક્સિન સામગ્રી ≤10 EU/mg હોવી જોઈએ.
પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમ અને શરતો
1. કેપિંગ પ્રોટોકોલ (પ્રતિક્રિયા વોલ્યુમ: 20 μL)
આ પ્રક્રિયા 10μg RNA (≥100 nt) ની કેપિંગ પ્રતિક્રિયાને લાગુ પડે છે અને તેને પ્રાયોગિક માંગ અનુસાર માપી શકાય છે.
I) 1.5 મિલી માઇક્રોફ્યુજ ટ્યુબમાં 10μg RNA અને ન્યુક્લિઝ-ફ્રી H2O ને 15.0 μL ના અંતિમ વોલ્યુમમાં ભેગું કરો.*10×કેપિંગ બફર: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)
2) 5 મિનિટ માટે 65℃ પર ગરમ કરો અને ત્યારબાદ 5 મિનિટ માટે આઇસ બાથ કરો.
3) ઉલ્લેખિત ક્રમમાં નીચેના ઘટકો ઉમેરો
| Cસમર્થક | Vઓલ્યુમ |
| વિકૃત આરએનએ (≤10μg, લંબાઈ≥100 nt) | 15 μL |
| 10×કેપિંગ બફર* | 2 μL |
| GTP (10 એમએમ) | 1 μL |
| SAM (2 એમએમ) | 1 μL |
| વેક્સિનિયા વાયરસ કેપિંગ એન્ઝાઇમ (10U/μL) | 1 μL |
*10×કેપિંગ બફર: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)
4) 37°C તાપમાને 30 મિનિટ માટે ઉકાળો, RNA હવે બંધ છે અને ડાઉનસ્ટ્રીમ એપ્લિકેશન માટે તૈયાર છે.
2. 5′ ટર્મિનલ લેબલીંગ પ્રતિક્રિયા (પ્રતિક્રિયા વોલ્યુમ: 20 μL)
આ પ્રોટોકોલ 5´ ટ્રાઇફોસ્ફેટ ધરાવતા RNAને લેબલ કરવા માટે રચાયેલ છે અને તેને માંગ પ્રમાણે માપી શકાય છે.લેબલ ઇન્કોર્પોરેશનની કાર્યક્ષમતા RNA: GTP, તેમજ RNA નમૂનાઓમાં GTP સામગ્રીના દાઢ ગુણોત્તર દ્વારા પ્રભાવિત થશે.
1) 1.5 મિલી માઇક્રોફ્યુજ ટ્યુબમાં RNA અને ન્યુક્લિઝ-ફ્રી H2O ની યોગ્ય માત્રાને 14.0 μL ના અંતિમ વોલ્યુમમાં ભેગું કરો.
2) 5 મિનિટ માટે 65℃ પર ગરમ કરો અને ત્યારબાદ 5 મિનિટ માટે આઇસ બાથ કરો.
3) ઉલ્લેખિત ક્રમમાં નીચેના ઘટકો ઉમેરો.
| Cસમર્થક | Vઓલ્યુમ |
| વિકૃત આરએનએ | 14 μL |
| 10×કેપિંગ બફર | 2 μL |
| GTP મિશ્રણ** | 2 μL |
| SAM (2 એમએમ) | 1 μL |
| વેક્સિનિયા વાયરસ કેપિંગ એન્ઝાઇમ (10U/μL) | 1 μL |
** GTP MIX એ GTP અને થોડી સંખ્યામાં માર્કર્સનો સંદર્ભ આપે છે.GTP ની સાંદ્રતા માટે, સંદર્ભ લોનોંધ 3.
4) 37°C પર 30 મિનિટ માટે ઉકાળો, RNA 5′ છેડો હવે લેબલ થયેલ છે અને ડાઉનસ્ટ્રીમ માટે તૈયાર છે
અરજીઓ
1. ટ્રાન્સલેશન એસેસ/ઇન વિટ્રો ટ્રાન્સલેશન પહેલા mRNA કેપિંગ
2. mRNA ના 5´ અંતનું લેબલીંગ
ઉપયોગ પર નોંધો
1.વેક્સિનિયા કેપિંગ એન્ઝાઇમ સાથે ઇન્ક્યુબેશન પહેલાં આરએનએના સોલ્યુશનને ગરમ કરવાથી ટ્રાન્સક્રિપ્ટના 5'છેડા પર ગૌણ માળખું દૂર થાય છે.જાણીતા ઉચ્ચ સંરચિત 5´એન્ડ સાથે ટ્રાન્સક્રિપ્ટ માટે સમય 60 મિનિટ સુધી લંબાવો.
2. કેપિંગ પ્રતિક્રિયાઓ માટે ઉપયોગમાં લેવાતા RNA ને ઉપયોગ કરતા પહેલા શુદ્ધ કરવું જોઈએ અને ન્યુક્લિઝ-મુક્ત પાણીમાં સસ્પેન્ડ કરવું જોઈએ.EDTA હાજર ન હોવો જોઈએ અને સોલ્યુશન ક્ષાર મુક્ત હોવું જોઈએ.
3. 5´ છેડાને લેબલ કરવા માટે, કુલ GTP સાંદ્રતા પ્રતિક્રિયામાં mRNA ની દાઢ સાંદ્રતા કરતાં લગભગ 1-3 ગણી હોવી જોઈએ.
4. પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીના વોલ્યુમને વાસ્તવિક અનુસાર ઉપર અથવા નીચે માપી શકાય છે.
