એન્ડોફ્રી પ્લાઝમિડ મેક્સી કીટ
આ કીટ બેક્ટેરિયાને લીઝ કરવા માટે સુધારેલ SDS-આલ્કલાઇન લિસિસ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને, 150 - 300 મિલી બેક્ટેરિયલ સોલ્યુશનમાંથી નિષ્કર્ષણ માટે યોગ્ય છે.ક્રૂડ અર્કને એક અનન્ય એન્ડોટોક્સિન સ્કેવેન્જર સાથે પસંદગીયુક્ત રીતે જોડવામાં આવે છે અને એન્ડોટોક્સિનને દૂર કરવા માટે સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા અલગ કરવામાં આવે છે.પછી, સિલિકા જેલ મેમ્બ્રેન ઉચ્ચ-મીઠું અને ઓછા-પીએચની સ્થિતિમાં સોલ્યુશનમાં પ્લાઝમિડ ડીએનએ સાથે પસંદગીયુક્ત રીતે જોડાય છે.આ પછી અશુદ્ધિઓ અને અન્ય બેક્ટેરિયલ ઘટકોને દૂર કરવા માટે વૉશ બફર ઉમેરવામાં આવે છે.છેલ્લે, સિલિકોન મેટ્રિક્સ મેમ્બ્રેનમાંથી શુદ્ધ પ્લાઝમિડ ડીએનએ બહાર કાઢવા માટે ઓછા-મીઠા, ઉચ્ચ-પીએચ ઇલ્યુશન બફરનો ઉપયોગ થાય છે.સિલિકા જેલ મેમ્બ્રેન ખાસ શોષણ પટલનો ઉપયોગ કરે છે, અને કૉલમ અને કૉલમ વચ્ચેના શોષણની રકમનો તફાવત ખૂબ જ નાનો છે અને પુનરાવર્તિતતા સારી છે.ફેનોલ, ક્લોરોફોર્મ અને અન્ય ઝેરી રીએજન્ટની જરૂર નથી, અને ઇથેનોલ અવક્ષેપના પગલાં પણ નથી.આ કીટનો ઉપયોગ 80% -90% ના નિષ્કર્ષણ દર સાથે 0.2 -1.5 મિલિગ્રામ શુદ્ધ ઉચ્ચ-કોપી પ્લાઝમિડ ડીએનએ ઝડપથી કાઢવા માટે થઈ શકે છે.કીટ એક અનન્ય પ્રક્રિયા સૂત્રનો ઉપયોગ કરે છે જે એન્ડોટોક્સિનને દૂર કરે છે, એન્ડોટોક્સિનની સામગ્રી અત્યંત ઓછી છે અને સેલ ટ્રાન્સફેક્શન અસર ઉત્તમ છે.એક્સટ્રેક્ટેડ પ્લાઝમિડનો સીધો ઉપયોગ એન્ઝાઇમ પાચન, પીસીઆર, ઇન વિટ્રો ટ્રાન્સક્રિપ્શન, ટ્રાન્સફોર્મેશન, સિક્વન્સિંગ અને અન્ય મોલેક્યુલર બાયોલોજી પ્રયોગોમાં થઈ શકે છે.
સંગ્રહ શરતો
RNaseA ને -30 ~ -15℃ પર સંગ્રહિત કરવું જોઈએ અને ≤0℃ પર પરિવહન કરવું જોઈએ.
એન્ડોટોક્સિન સ્કેવેન્જર એક મહિના માટે 2 ~ 8℃ પર સ્ટોર કરી શકાય છે, લાંબા ગાળાના સ્ટોરેજ માટે -30 ~ -15℃ પર સ્ટોર કરી શકાય છેઅને ≤0℃ પર પરિવહન થાય છે.
અન્ય ઘટકો ઓરડાના તાપમાને (15 ~ 25℃) સંગ્રહિત કરવા જોઈએ અને ઓરડાના તાપમાને પરિવહન કરવા જોઈએ.
ઘટકો
| ઘટકો | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| બફર P1 | 75 મિલી |
| બફર P2 | 75 મિલી |
| બફર P4 | 75 મિલી |
| એન્ડોટોક્સિન સ્કેવેન્જર | 25 મિલી |
| બફર PW | 2 × 22 મિલી |
| બફર ટીબી | 20 મિલી |
| ફાસ્ટપ્યોર ડીએનએ મેક્સી કૉલમ્સ (દરેક 50 મિલી કલેક્શન ટ્યુબમાં) | 10 |
| એન્ડોટોક્સિન મુક્ત કલેક્શન ટ્યુબ | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, RNA દૂર કરવા માટે વપરાય છે.
બફર P1:બેક્ટેરિયલ સસ્પેન્શન બફર, પ્રથમ ઉપયોગ પહેલાં બફર P1 માં RNaseA ઉમેરો.
બફર P2:બેક્ટેરિયલ લિસિસ બફર (SDS/NaOH ધરાવે છે).
બફર P4:તટસ્થ બફર.
એન્ડોટોક્સિન સ્કેવેન્જર:ક્રૂડ પ્લાઝમિડ અર્કમાંથી અસરકારક રીતે એન્ડોટોક્સિન દૂર કરે છે.
બફર PW:બફર ધોવા, પ્રથમ ઉપયોગ કરતા પહેલા ઇથેનોલનું નિયત વોલ્યુમ ઉમેરો.
બફર ટીબી:ઉત્સર્જન બફર.
ફાસ્ટપ્યોર ડીએનએ મેક્સી કૉલમ્સ:પ્લાઝમિડ ડીએનએ શોષણ કૉલમ.
કલેક્શન ટ્યુબ 50 મિલી:ફિલ્ટ્રેટ કલેક્શન ટ્યુબ.
એન્ડોટોક્સિન મુક્ત કલેક્શન ટ્યુબ:પ્લાઝમિડ ડીએનએ કલેક્શન ટ્યુબ.
તૈયાર કરેલી સામગ્રી
સંપૂર્ણ ઇથેનોલ, આઇસોપ્રોપેનોલ, 50 મિલી રાઉન્ડ-બોટમ સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબ અને 50 મિલી એન્ડોટોક્સિન-મુક્તસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબ.
અરજીઓ
આ ઉત્પાદન 150 - 300 મિલી બેક્ટેરિયલ દ્રાવણમાંથી પ્લાઝમિડ્સના મોટા પાયે નિષ્કર્ષણ માટે યોગ્ય છે.રાતોરાત સંસ્કારી.
પ્રયોગ પ્રક્રિયા
1. 150 - 200 મિલી (300 મિલીથી વધુ નહીં) બેક્ટેરિયલ સોલ્યુશનને રાતોરાત સંવર્ધન કરો અને સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો1 - 2 મિનિટ માટે લગભગ 11,000 rpm (12,000 × g)સુપરનેટન્ટ કાઢી નાખો અને બેક્ટેરિયા એકત્રિત કરો.
Δ 50 મિલી કરતાં વધુ બેક્ટેરિયલ દ્રાવણ એકત્ર કરતી વખતે, બેક્ટેરિયાને બેક્ટેરિયલ સોલ્યુશન ઉમેરીને, સેન્ટ્રીફ્યુગેશન, સુપરનેટન્ટને કાઢી નાખીને અને અન્ય પગલાંઓ માટે સમાન 50 મિલી ટ્યુબમાં એકત્ર કરી શકાય છે.
ઘણી વખત.
2. સેન્ટ્રીફ્યુજમાં 7.5 મિલી બફર P1 ઉમેરો (કૃપા કરીને તપાસો કે RNaseA બફર P1 માં ઉમેરવામાં આવ્યું છે કે નહીં)બેક્ટેરિયા ધરાવતી ટ્યુબ અને વમળ અથવા પાઇપિંગ દ્વારા સારી રીતે ભળી દો.
Δ આ પગલામાં બેક્ટેરિયાનું સંપૂર્ણ રિસસ્પેન્શન ઉપજ માટે મહત્વપૂર્ણ છે, અને રિસસ્પેન્શન પછી કોઈ બેક્ટેરિયાના ઝુંડ ન હોવા જોઈએ.જો ત્યાં બેક્ટેરિયાના ઝુંડ હોય કે જે સંપૂર્ણપણે મિશ્રિત ન હોય, તો તે લિસિસને અસર કરશે, પરિણામે ઓછી ઉપજ અને શુદ્ધતા આવશે.જો બેક્ટેરિયલ સોલ્યુશનનું OD600 0.65 હોય, તો 150 મિલી બેક્ટેરિયલ સોલ્યુશનમાંથી બહાર કાઢતી વખતે 7.5 મિલી બફર પી1નો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે;જ્યારે OD600 0.75 હોય, ત્યારે 8 મિલી બફર P1 નો ઉપયોગ કરવો જોઈએ અને બફર P2 અને P4 ના વોલ્યુમો તે મુજબ બદલાવા જોઈએ.જો બેક્ટેરિયલ સોલ્યુશનની માત્રા 200 મિલી સુધી વધારવામાં આવે છે, તો ભલામણ કરવામાં આવે છે કેબફર્સ P1, P2 અને P4 નું પ્રમાણ પ્રમાણસર વધારવું.
3. સ્ટેપ 2 થી બેક્ટેરિયલ સસ્પેન્શનમાં 7.5 મિલી બફર P2 ઉમેરો અને 6 - 8 માટે હળવેથી ઉપર અને નીચે મિક્સ કરોવખત અને ઓરડાના તાપમાને 4-5 મિનિટ માટે સેવન કરો.
Δ સારી રીતે ભળવા માટે હળવેથી ઊંધી કરો.વોર્ટેક્સીંગ જીનોમિક ડીએનએ ફ્રેગમેન્ટેશનનું કારણ બનશે, જેના પરિણામે એક્સટ્રેક્ટેડ પ્લાઝમિડમાં જીનોમિક ડીએનએ ટુકડા થશે.આ સમયે, સોલ્યુશન ચીકણું અને અર્ધપારદર્શક બને છે, જે દર્શાવે છે કે બેક્ટેરિયા સંપૂર્ણ રીતે લુપ્ત થઈ ગયા છે.પ્લાઝમિડ્સના વિનાશને ટાળવા માટે સમયગાળો 5 મિનિટથી વધુ ન હોવો જોઈએ.જો ઉકેલ સ્પષ્ટ ન હોય, તો ઘણા બેક્ટેરિયા પરિણમી શકે છેઅપૂર્ણ લિસિસ, તેથી બેક્ટેરિયાનું પ્રમાણ યોગ્ય રીતે ઘટાડવું જોઈએ.
4. સ્ટેપ 3 થી બેક્ટેરિયલ સસ્પેન્શનમાં 7.5 મિલી બફર P4 ઉમેરો અને સોલ્યુશનને સંપૂર્ણપણે બફર P2 ને બેઅસર કરવા દેવા માટે 6-8 વખત હળવેથી ઊંધી કરો.આ સમયે, સફેદ ફ્લોક્યુલન્ટ અવક્ષેપ દેખાવા જોઈએ.10 – 15 મિનિટ માટે લગભગ 11,000 rpm (12,000 × g) થી વધુ પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો, સુપરનેટન્ટને કાળજીપૂર્વક નવી 50 મિલી રાઉન્ડ-બોટમ સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબ (સ્વ-તૈયાર) માં પીપેટ કરો અને ટાળો.તરતા સફેદ અવક્ષેપને એસ્પિરેટ કરો.
Δ બફર P4 ઉમેરો અને સારી રીતે મિશ્રણ કરવા માટે તરત જ ઊંધું કરો.સ્થાનિક અવક્ષેપના ઉત્પાદનને અટકાવવા માટે જ્યાં સુધી તટસ્થીકરણને અસર કરી શકે તે માટે સફેદ અવક્ષેપ સમગ્ર ઉકેલમાં સમાનરૂપે વિતરિત ન થાય ત્યાં સુધી ટ્યુબને ઊભા રહેવા દો.જો સેન્ટ્રીફ્યુગેશન પહેલાં એકસમાન સફેદ ફ્લોક્યુલન્ટ અવક્ષેપ ન હોય અને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન પછી સુપરનેટન્ટ સ્પષ્ટ ન હોય, તો ટ્યુબબીજી 5 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ.
5. સ્ટેપ 4 થી સુપરનેટન્ટમાં એન્ડોટોક્સિન સ્કેવેન્જરનું 0. 1 ગણું (સુપરનેટન્ટ વોલ્યુમના 10%, લગભગ 2.2 મિલી) વોલ્યુમ ઉમેરો અને મિશ્રણ કરવા માટે ઊંધું કરો.સોલ્યુશનને બરફના સ્નાનમાં મૂકો અથવા 5 મિનિટ માટે કચડી બરફ (અથવા રેફ્રિજરેટર ફ્રીઝર) માં દાખલ કરો જ્યાં સુધી સોલ્યુશન ટર્બિડમાંથી સ્પષ્ટ અને પારદર્શક (અથવા હજુ પણ) ન બદલાય.સહેજ ટર્બિડ), અને ક્યારેક ક્યારેક ઘણી વખત ભળી જાય છે.
Δ એંડોટોક્સિન સ્કેવેન્જર સુપરનેટન્ટમાં ઉમેરાયા પછી, સુપરનેટન્ટ ટર્બિડ થઈ જશે પરંતુબરફના સ્નાનમાં ઠંડુ થયા પછી સુપરનેટન્ટ સ્પષ્ટ (અથવા સહેજ ટર્બિડ) થવું જોઈએ.
6. સુપરનેટન્ટને ઓરડાના તાપમાને (>25℃) 10 - 15 મિનિટ માટે મૂક્યા પછી, તે ગંદુ થઈ જશેતેનું તાપમાન ઓરડાના તાપમાને વધે છે.પછી સુપરનેટન્ટને ભેળવવા માટે ઊંધું કરવું જોઈએ.
Δ જો ઓરડાનું તાપમાન ઓછું હોય અથવા તમે નિષ્કર્ષણનો સમય ઘટાડવા માંગતા હો, તો સુપરનેટન્ટને 37 ~ 42 ℃ પાણીના સ્નાનમાં 5 - 10 મિનિટ માટે ઉકાળી શકાય છે અને સુપરનેટન્ટ પછી આગળનું પગલું હાથ ધરવામાં આવી શકે છે.અસ્વસ્થ બની જાય છે.
7. તબક્કાને અલગ કરવા માટે ઓરડાના તાપમાને 10 મિનિટ માટે લગભગ 11,000 rpm (12,000 × g) પર સુપરનેટન્ટને સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો (તાપમાન >25℃ હોવું જોઈએ).ઉપલા જલીય તબક્કામાં ડીએનએ હોય છે જ્યારે નીચલા વાદળી તૈલી તબક્કાના સ્તરમાં એન્ડોટોક્સિન અને અન્ય અશુદ્ધિઓ હોય છે.ટ્રાન્સફર કરોડીએનએ-સમાવતી જલીય તબક્કો નવી નળીમાં અનેતેલયુક્ત સ્તર કાઢી નાખો.
Δ સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દરમિયાન તાપમાન 25 ℃ થી વધુ હોવું જોઈએ કારણ કે અસરકારક તબક્કા વિભાજન થતું નથીજો તાપમાન ખૂબ ઓછું હોય તો થાય છે.
Δ જો તબક્કો વિભાજન અસરકારક ન હોય, તો સેન્ટ્રીફ્યુગેશન તાપમાન 30 ℃ સુધી ગોઠવી શકાય છે અનેસેન્ટ્રીફ્યુગેશનનો સમય 15 મિનિટ સુધી વધારી શકાય છે.
Δ વાદળી તેલયુક્ત સ્તરને ચૂસશો નહીં કારણ કે તેમાં એન્ડોટોક્સિન અને અન્ય અશુદ્ધિઓ છે.
મિકેનિઝમ
રિસસ્પેન્શન લિસિસ ન્યુટ્રલાઇઝેશન
◇ 7.5 મિલી બફર P1 ઉમેરો
◇ 7.5 મિલી બફર P2 ઉમેરો
◇ 7.5 મિલી બફર P4 ઉમેરો
એન્ડોટોક્સિન દૂર કરવું
◇ એન્ડોટોક્સિન સ્કેવેન્જરના સુપરનેટન્ટ વોલ્યુમના 0. 1 ગણા ઉમેરો
બંધનકર્તા અને ધોવા
◇ આઇસોપ્રોપેનોલના 0.5 ગણા વોલ્યુમ ઉમેરો
◇ 10 મિલી બફર PW ઉમેરો
◇ 10 મિલી બફર PW ઉમેરો
એલ્યુશન
◇ 1 - 2 મિલી બફર ટીબી અથવા એન્ડોટોક્સિન-મુક્ત ddH2O ઉમેરો
