હોટસ્ટાર્ટ ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝ
હોટ સ્ટાર્ટ ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝ (એન્ટિબોડી મોડિફિકેશન) એ થર્મસ એક્વેટિકસ YT-1 માંથી હોટ-સ્ટાર્ટ થર્મોસ્ટેબલ ડીએનએ પોલિમરેઝ છે, જે 5′→3′ પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિ અને 5' ફ્લૅપ એન્ડોન્યુક્લિઝ પ્રવૃત્તિ ધરાવે છે.હોટ-સ્ટાર્ટ Taq DNA પોલિમરેઝ એ Taq DNA પોલિમરેઝ છે જે થર્મોલાબિલ Taq એન્ટિબોડીઝ દ્વારા સંશોધિત થાય છે.એન્ટિબોડી ફેરફારથી પીસીઆરની વિશિષ્ટતા, સંવેદનશીલતા અને ઉપજમાં વધારો થયો છે.
ઘટકો
| ઘટક | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq બફર | 4×1 એમએલ | 4×10 એમએલ | 4×50 એમએલ | 5×400 એમએલ |
| હોટ સ્ટાર્ટ ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝ (એન્ટિબોડી સંશોધિત) (5 U/μL) | 0.1 એમએલ | 1 એમએલ | 5 એમએલ | 10×5 એમએલ |
અરજીઓ
10 mM Tris-HCl (pH 7.4 at 25℃), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.5% Tween20, 0.5% IGEPALCA-630 અને 50% Glycerol.
સંગ્રહ સ્થિતિ
0°C થી નીચે પરિવહન અને -25°C~-15°C પર સંગ્રહિત કરવું.
એકમ વ્યાખ્યા
એક એકમ એ એન્ઝાઇમના જથ્થા તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવે છે જે 75 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર 30 મિનિટમાં એસિડ અદ્રાવ્ય સામગ્રીમાં 15 nmol dNTP નો સમાવેશ કરે છે.
ગુણવત્તા નિયંત્રણ
1.Endonuclease પ્રવૃત્તિ:37℃ પર 4 કલાક માટે 4 μg pUC19 ડીએનએ સાથે 20 U એન્ઝાઇમનું સેવન કરવાથી જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નિર્ધારિત ડીએનએનું કોઈ શોધી શકાય તેવું ડિગ્રેડેશન થયું નથી.
2.5 kb લેમ્બડા પીસીઆર:200 µM dNTPs અને 0.2 µM પ્રાઈમર્સની હાજરીમાં Taq DNA પોલિમરેઝના 1.25 એકમો સાથે 5 ng Lambda DNA ના PCR એમ્પ્લીફિકેશનના 25 ચક્રો અપેક્ષિત 5 kb ઉત્પાદનમાં પરિણમે છે.
3.Exonuclease પ્રવૃત્તિ:37℃ પર 30 મિનિટ માટે 10 nmol 5´-FAM ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ સાથે ઓછામાં ઓછું 12.5 U Taq DNA પોલિમરેઝ ધરાવતી 50 μl પ્રતિક્રિયાનું સેવન કરવાથી કોઈ શોધી શકાય તેવું અધોગતિ મળતું નથી.
4.RNase પ્રવૃત્તિ:37°C તાપમાને 2 કલાક માટે 1μg RNA ટ્રાન્સક્રિપ્ટ સાથે 20 U ની એન્ઝાઇમ ધરાવતી 10 µL પ્રતિક્રિયાના સેવનથી જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નિર્ધારિત આરએનએનું કોઈ શોધી શકાય તેવું અધઃપતન થયું નથી.
5.ગરમી નિષ્ક્રિયતા:ના.
પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમ
| ઘટકો | વોલ્યુમ |
| ટેમ્પલેટ ડીએનએa | વૈકલ્પિક |
| 10 μM ફોરવર્ડ પ્રાઈમર | 0.5 μL |
| 10 μM રિવર્સ પ્રાઈમર | 0.5 μL |
| dNTP મિક્સ (10mM દરેક) | 0.5 μL |
| 5×HC Taq બફર | 5 μL |
| તાક ડીએનએ પોલિમરેઝb(5U/μL) | 0.125 μL |
| ન્યુક્લિઝ-મુક્ત પાણી | 25 μL સુધી |
નોંધો:
1) એ.
| ડીએનએ | રકમ |
| જીનોમિક | 1 એનજી -1 μg |
| પ્લાઝમિડ અથવા વાયરલ | 1 પૃષ્ઠ-1 એનજી |
2) બી.Taq DNA પોલિમરેઝની શ્રેષ્ઠ સાંદ્રતા વિશિષ્ટ એપ્લિકેશન્સમાં 5-50 યુનિટ/એમએલ (0.1-0.5 યુનિટ/25 µL પ્રતિક્રિયા) સુધીની હોઈ શકે છે.
થર્મલ સાયકલિંગ પ્રોટોકોલ
પીસીઆર
| પગલું | તાપમાન(°C) | સમય | સાયકલ |
| પ્રારંભિક વિકૃતિકરણa | 95 ℃ | 1-3 મિનિટ | - |
| વિકૃતિકરણ | 95 ℃ | 15-30 સે | 30-35 સાયકલ |
| એનેલીંગb | 45-68 ℃ | 15-60 સે | |
| વિસ્તરણ | 68 ℃ | 1kb/મિનિટ | |
| અંતિમ વિસ્તરણ | 68 ℃ | 5 મિનિટ | - |
નોંધો:
1) 95°C પર 1 મિનિટનું પ્રારંભિક વિકૃતિકરણ મોટાભાગના એમ્પ્લીફિકેશન માટે પૂરતું છે.મુશ્કેલ નમૂનાઓ માટે, 95 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર 2-3 મિનિટની લાંબી વિકૃતિકરણની ભલામણ કરવામાં આવે છે.કોલોની પીસીઆર સાથે, 95 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર પ્રારંભિક 5 મિનિટ ડિનેચરેશનની ભલામણ કરવામાં આવે છે.
2) એન્નીલિંગ સ્ટેપ સામાન્ય રીતે 15-60 સેકન્ડનું હોય છે.એનિલિંગ તાપમાન પ્રાઈમર જોડીના Tm પર આધારિત છે અને સામાન્ય રીતે 45-68℃ છે.
