Rnase અવરોધક
મ્યુરિન આરનેઝ ઇન્હિબિટર એ રિકોમ્બિનન્ટ મ્યુરિન આરનેઝ ઇન્હિબિટર છે જે ઇ.કોલીમાંથી વ્યક્ત અને શુદ્ધ થાય છે.તે બિન-સહસંયોજક બંધન દ્વારા 1:1 ગુણોત્તરમાં RNase A, B અથવા C સાથે જોડાય છે, ત્યાં ત્રણ ઉત્સેચકોની પ્રવૃત્તિને અટકાવે છે અને આરએનએને અધોગતિથી બચાવે છે.જો કે, એસ્પરગિલસમાંથી RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H અથવા RNase સામે તે અસરકારક નથી.Murine RNase અવરોધકનું પરીક્ષણ RT-PCR, RT-qPCR અને IVT mRNA દ્વારા કરવામાં આવ્યું હતું અને તે વિવિધ કોમર્શિયલ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ, DNA પોલિમરેસિસ અને RNA પોલિમરેસિસ સાથે સુસંગત હતું.
માનવ RNase અવરોધકોની તુલનામાં, મ્યુરિન RNase અવરોધકોમાં બે સિસ્ટીન નથી કે જે ઓક્સિડેશન માટે અત્યંત સંવેદનશીલ હોય છે જે અવરોધકને નિષ્ક્રિય કરે છે.જે તેને ડીટીટીની ઓછી સાંદ્રતા (1 એમએમ કરતા ઓછી) પર સ્થિર બનાવે છે.આ લક્ષણ તેને પ્રતિક્રિયાઓમાં ઉપયોગ માટે યોગ્ય બનાવે છે જ્યાં DTT ની ઊંચી સાંદ્રતા પ્રતિક્રિયા માટે પ્રતિકૂળ હોય છે (દા.ત. રીઅલ-ટાઇમ RT-PCR).
Aઅરજી
આ ઉત્પાદનનો ઉપયોગ કોઈપણ પ્રયોગમાં વ્યાપકપણે થઈ શકે છે જ્યાં RNA અધોગતિ ટાળવા માટે RNase હસ્તક્ષેપ શક્ય હોય, જેમ કે:
1.cDNA, RT-PCR, RT-qPCR, વગેરેના પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડનું સંશ્લેષણ.
2.ઇન વિટ્રો ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન/અનુવાદ દરમિયાન આરએનએને અધોગતિથી સુરક્ષિત કરે છે (દા.ત., ઇન વિટ્રો વાયરલ પ્રતિકૃતિ સિસ્ટમ).
3.આરએનએ અલગ અને શુદ્ધિકરણ દરમિયાન RNase પ્રવૃત્તિમાં અવરોધ.
સંગ્રહ શરતો
ઉત્પાદન -25～- 15 ℃ પર સ્ટોર કરી શકાય છે, જે 2 વર્ષ માટે માન્ય છે.
સંગ્રહ બફર
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.6, 25 ℃), 8 mM DTT અને 50% ગ્લિસરોલ.
એકમની વ્યાખ્યા
રિબોન્યુક્લીઝ A ની 5ng પ્રવૃત્તિને 50% દ્વારા રોકવા માટે જરૂરી મ્યુરિન RNase અવરોધકની માત્રાને એક એકમ (U) તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવી હતી.
પ્રોટીનનું મોલેક્યુલર વજન
મ્યુરિન RNase અવરોધકનું પરમાણુ વજન 50 kDa છે.
ગુણવત્તા નિયંત્રણ
એક્સોનોક્લીઝ પ્રવૃત્તિ:
16 કલાક માટે 37℃ પર 1 μg λ -હિન્દ III ડાયજેસ્ટ ડીએનએ સાથે 40 U ના મ્યુરિન RNase અવરોધક એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નિર્ધારિત કોઈ અધોગતિ પેદા કરતું નથી.
એન્ડોન્યુક્લીઝ પ્રવૃત્તિ:
1μg λ DNA સાથે 1μg λ DNA સાથે 40 U 37℃ પર 16 કલાક માટે એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નિર્ધારિત કોઈ અધોગતિ પેદા કરતું નથી.
નિકિંગ પ્રવૃત્તિ:
1μg pBR322 સાથે 1μg pBR322 નું 40U 37℃ પર 16 કલાક માટે એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નિર્ધારિત કોઈ અધોગતિ પેદા કરતું નથી.
RNase પ્રવૃત્તિ:
37℃ પર 4h માટે 1.6μg MS2 RNA સાથે મ્યુરિન RNase અવરોધકનું 40U એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નિર્ધારિત કોઈ અધોગતિ પેદા કરતું નથી.
E.કોલી ડીએનએ:
E. coli 16S rRNA લોકસ માટે વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સ સાથે TaqMan qPCR નો ઉપયોગ કરીને E. coli જિનોમિક ડીએનએની હાજરી માટે 40 U ના મુરિન RNase અવરોધકની તપાસ કરવામાં આવે છે.ઇ. કોલી જીનોમિક ડીએનએ દૂષણ ≤ 0.1 pg/40 U છે.
Notes
1. હિંસક ઓસિલેશન અથવા stirring એન્ઝાઇમ નિષ્ક્રિયતા તરફ દોરી જશે.
2. આ અવરોધકની મહત્તમ તાપમાન શ્રેણી 25-55 ℃ હતી, અને તે 65℃ અને તેથી વધુ તાપમાને નિષ્ક્રિય થઈ હતી.
3. RNase H, RNase 1 અને RNase T1 ની પ્રવૃત્તિઓ મ્યુરિન RNase અવરોધક દ્વારા અટકાવવામાં આવી ન હતી.
4. RNase પ્રવૃત્તિનો અવરોધ pH ની વિશાળ શ્રેણીમાં જોવા મળ્યો હતો (pH 5-9 બધા સક્રિય હતા), અને સૌથી વધુ પ્રવૃત્તિ pH 7-8 પર જોવા મળી હતી.
5.કારણ કે રિબોન્યુક્લીઝ સામાન્ય રીતે ડિનેચરિંગ શરતો હેઠળ પ્રવૃત્તિ જાળવી રાખે છે, RNase ઇન્હિબિટર પરમાણુઓ કે જે રિબોન્યુક્લિઝ સાથે જટિલ હોય છે તેને ડિનેચર કરવાનું ટાળવા માટે કાળજી લેવી જોઈએ.સક્રિય રિબોન્યુક્લીઝના પ્રકાશનને રોકવા માટે, 50 °C કરતા વધુ તાપમાન અને યુરિયા અથવા અન્ય ડિનેચરિંગ એજન્ટોની ઊંચી સાંદ્રતા ટાળવી જોઈએ.
