પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ પીસીઆર કીટ
કેટ નંબર: HCR2020A
પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ પીસીઆર કીટ છોડના પાંદડા, બીજ વગેરેના સીધા એમ્પ્લીફિકેશન માટે યોગ્ય છે અને તેનો ઉપયોગ છોડના નમૂનાઓની ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સ્ક્રીનીંગ માટે કરી શકાય છે જેમાં પોલિસેકરાઇડ્સ અને પોલિફીનોલ્સ શામેલ નથી.નિર્દેશિત ઉત્ક્રાંતિ પર આધારિત ડાયરેક્ટ એમ્પ્લીફિકેશન ડીએનએ પોલિમરેઝ છોડમાં પીસીઆર અવરોધકોને શ્રેષ્ઠ સહનશીલતા ધરાવે છે.દરમિયાન, તે ઉચ્ચ એમ્પ્લીફિકેશન કામગીરી જાળવી રાખે છે, જે 5 kb ની અંદર DNA ટુકડાઓના એમ્પ્લીફિકેશન માટે યોગ્ય છે.કીટમાં અનન્ય Lysis બફર A નો ઉપયોગ તાજા અથવા સ્થિર છોડની પેશીઓને લીસ કરવા માટે કરી શકાય છે.તે ચલાવવા માટે સરળ છે અને lysate શુદ્ધિકરણ વગર એમ્પ્લીફિકેશન માટે નમૂના તરીકે ઉપયોગ કરી શકાય છે.સિસ્ટમમાં રક્ષણાત્મક એજન્ટો છે જે ક્રૂડના નમૂનાઓને વારંવાર ઠંડું અને પીગળ્યા પછી અસરકારક રીતે વિસ્તૃત કરવામાં સક્ષમ કરે છે.2 × પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ માસ્ટર મિક્સને એમ્પ્લીફિકેશન રિએક્શન કરવા માટે માત્ર પ્રાઇમર્સ અને ટેમ્પલેટ્સ ઉમેરવાની જરૂર છે, જેનાથી પાઇપિંગ કામગીરીમાં ઘટાડો થાય છે અને પરિણામોની તપાસ થ્રુપુટ અને પુનઃઉત્પાદનક્ષમતામાં સુધારો થાય છે.
ઘટકો
| ઘટકો | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ માસ્ટર મિક્સ | 1.25 મિલી | 4×1.25 મિલી |
| પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ લિસિસ બફર એ | 5 મિલી | 20 મિલી |
| પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ લિસિસ બફર B* | 5 મિલી | 20 મિલી |
*પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ લિસિસ બફર B એ વૈકલ્પિક રીએજન્ટ છે, જેનો ઉપયોગ પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ લિસિસ બફર A ને નિષ્ક્રિય કરવા માટે નમૂનાઓના સંગ્રહ સમયને લંબાવવા માટે થાય છે.વાસ્તવિક પરિસ્થિતિ અનુસાર તેનો ઉપયોગ કરી શકાય છે.
સંગ્રહ શરતો
2 × પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ માસ્ટર મિક્સ, -30 ~ -15℃ પર સ્ટોર કરો અને વારંવાર ઠંડું અને પીગળવાનું ટાળો;પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ લિસિસ બફર, -30 ~ -15℃ અથવા 2 ~ 8℃ પર સ્ટોર કરો.
પ્રયોગ પ્રક્રિયા
નમૂના પ્રક્રિયા-છોડના પાન
સીધી પદ્ધતિ:યુવાન પાંદડાઓનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.નાના અને સમાન નમૂના મેળવવા માટે 0.5 - 3 મીમીના નિશ્ચિત વ્યાસ સાથે છિદ્ર પંચનો ઉપયોગ કરો અને પછી નમૂનાને પીસીઆર સિસ્ટમમાં સીધો ઉમેરો (50 μl સિસ્ટમની ભલામણ કરવામાં આવે છે).નોંધ, ખાતરી કરો કે નમૂના પીસીઆર સોલ્યુશનમાં છે અને નળીની દિવાલની સામે નથી.જો ડાયરેક્ટ પીસીઆરનો ઉપયોગ લાંબા ટુકડાઓ અને જટિલ નમૂનાઓને વિસ્તૃત કરવા માટે કરવામાં આવે છે, તો ટેમ્પલેટ તરીકે નાના વ્યાસ (0.5 - 1 મીમી) ના નમૂનાનો ઉપયોગ કરવાથી વધુ સારા પરિણામો મેળવવામાં મદદ મળી શકે છે.
ગ્રાઇન્ડીંગ લિસિસ પદ્ધતિ:યુવાન પાંદડાઓનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.પાંદડાનો એક નાનો ટુકડો લો (આશરે 1 - 3 મીમી વ્યાસ), તેને 20 μl પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ લિસિસ બફર એબમાં મૂકો, અને તેને શક્ય તેટલું ગ્રાઇન્ડ કરો (આ પગલું 100 μl પીપેટ ટીપ સાથે પાંદડાને સ્ક્વિઝ કરીને કરી શકાય છે. નમૂનાને મેશ કરવા માટે).જો પાંદડાની પેશીઓના મોટા જથ્થાનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે (7 મીમીથી વધુ નહીં), તો મંદન બફરનું પ્રમાણ 50 μl સુધી વધારવું.પાંદડા ગ્રાઉન્ડ થયા પછી, સોલ્યુશન લીલું દેખાવું જોઈએ.સંક્ષિપ્ત સેન્ટ્રીફ્યુગેશન પછી, પ્રતિક્રિયા નમૂના તરીકે પીસીઆર સિસ્ટમમાં સુપરનેટન્ટનો 1 μl ઉમેરો.
થર્મલ લિસિસ પદ્ધતિ:યુવાન પાંદડાઓનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.પાંદડાનો એક નાનો ટુકડો લો (આશરે 1 - 3 મીમી વ્યાસ), તેને 20 μl પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ લિસિસ બફર A માં મૂકો અને તેને 5 - 10 મિનિટ માટે 95°C પર ગરમ કરો.લીસીસનો સમય એ પાંદડા માટે યોગ્ય રીતે લંબાવી શકાય છે જે લીસ કરવા મુશ્કેલ હોય છે (20 મિનિટથી વધુ નહીં).જો પાંદડાની પેશીના મોટા જથ્થાનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે (7 મીમીથી વધુ નહીં), તો મંદન બફરનું પ્રમાણ 50 μl સુધી વધારવું.ગરમ કર્યા પછી, સંક્ષિપ્તમાં સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો અને પ્રતિક્રિયા નમૂના તરીકે પીસીઆર સિસ્ટમમાં 1 μl સુપરનેટન્ટ ઉમેરો.
નમૂના પ્રક્રિયા- બીજ વાવો
ગ્રાઇન્ડીંગ લિસિસ પદ્ધતિ:5 મીમીના વ્યાસવાળા બીજને કાપવા માટે સ્કેલપેલનો ઉપયોગ કરો, તેમને પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ લિસિસ બફર A ના 100 μl માં ઉમેરો અને નમૂનાને પીપેટ ટીપ અથવા અન્ય સાધનો વડે ગ્રાઇન્ડ કરો.થોડા સમય માટે વોર્ટેક્સ કરો અને ઓરડાના તાપમાને 3 - 5 મિનિટ માટે ઊભા રહેવા દો.ખાતરી કરો કે બીજનો નમૂનો મંદન બફરમાં ડૂબી ગયો છે.સંક્ષિપ્ત સેન્ટ્રીફ્યુગેશન પછી, પ્રતિક્રિયા નમૂના તરીકે પીસીઆર સિસ્ટમમાં સુપરનેટન્ટનો 1 μl ઉમેરો.
થર્મલ લિસિસ પદ્ધતિ:5 મીમીના વ્યાસવાળા બીજને કાપવા માટે સ્કેલપેલનો ઉપયોગ કરો, તેમને પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ લિસિસ બફર A ના 100 μl માં ઉમેરો અને 5 - 10 મિનિટ માટે 95°C પર ગરમ કરો.લીસીસનો સમય એ પાંદડા માટે યોગ્ય રીતે લંબાવી શકાય છે કે જે લીસ કરવા મુશ્કેલ છે (30 મિનિટથી વધુ નહીં).ગરમ કર્યા પછી, સંક્ષિપ્તમાં સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો, અને પ્રતિક્રિયા નમૂના તરીકે PCR સિસ્ટમમાં 1 μl સુપરનેટન્ટ ઉમેરો.
aકાતર અથવા અન્ય સાધનોનો ઉપયોગ યોગ્ય કદના નમૂનાઓ કાપવા માટે પણ થઈ શકે છે;જો પંચ અથવા કાતરનો પુનઃઉપયોગ કરવામાં આવે છે, તો નમૂનાઓ વચ્ચે ક્રોસ-પ્રદૂષણ અટકાવવા માટે દરેક ઉપયોગ પહેલાં તેને 2% સોડિયમ હાઇપોક્લોરાઇટ સોલ્યુશનથી સાફ કરવું જોઈએ.
bખાતરી કરો કે પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ લિસિસ બફર ઉપયોગ કરતા પહેલા સંપૂર્ણપણે ઓગળી જાય છે.જો બફર ચીકણું હોય અથવા અવક્ષેપ ધરાવતું હોય, તો ઉપયોગ કરતા પહેલા તેને સંપૂર્ણપણે ઓગળવા માટે તેને 37℃ પર ગરમ કરી શકાય છે.
cપ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં ટેમ્પ્લેટનું પ્રમાણ છોડની સામગ્રી અને ઉમેરવામાં આવેલા મંદીના જથ્થામાં તફાવત અનુસાર યોગ્ય રીતે ગોઠવી શકાય છે.
પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ લિસિસ બફર
આ ઉત્પાદનમાં સમાયેલ પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ લિસિસ બફર Aને મોટાભાગના છોડના પેશીઓના જીનોમને મુક્ત કરવા માટે સખત રીતે ઑપ્ટિમાઇઝ કરવામાં આવ્યું છે અને તે 4℃ પર ક્રૂડ પ્લાન્ટ્સના ટૂંકા ગાળાના સંગ્રહ માટે યોગ્ય છે.જો નમૂનાને લાંબા સમય સુધી સંગ્રહિત કરવાની જરૂર હોય (દા.ત., 1 – 2 મહિના), તો સુપરનેટન્ટને નવી EP ટ્યુબમાં સ્થાનાંતરિત કરવાની અને તેને -20℃ પર સંગ્રહિત કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.નમૂનાઓને વધુ સ્થિર રીતે સંગ્રહિત કરવા માટે, ટ્રાન્સફર કરાયેલા સુપરનેટન્ટમાં પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ લાયસિસ બફર Bની સમાન માત્રા ઉમેરો, સારી રીતે મિક્સ કરો અને -20℃ પર સ્ટોર કરો.સ્થિર સંગ્રહ સમય છોડના નમૂનાઓ અને રાજ્યો સાથે બદલાય છે.
પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમ
| ડીડીએચ2O | થી 20.0 μl | થી 50.0 μl |
| 2 × પ્લાન્ટ ડાયરેક્ટ માસ્ટર મિક્સa | 10.0 µl | 25.0 µ |
| પ્રાઈમર 1 (10 µM) | 0.8 μl | 2.0 μl |
| પ્રાઈમર 2 (10 µM)b | 0.8 μl | 2.0 μl |
| છોડના પાન/ક્રૂડ અર્કનો નમૂનો(સેમ્પલ પ્રોસેસિંગનો સંદર્ભ લો) | 0.5 – 3 મીમી લીફ ડિસ્ક/x µl | 0.5 – 3 મીમી લીફ ડિસ્ક/x µl |
aતેમાં Mg છે2+2 એમએમની અંતિમ સાંદ્રતા પર.
bદરેક બાળપોથી માટે 0.4μM ની અંતિમ સાંદ્રતાનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.પ્રાઇમર્સનો વધુ પડતો ઉપયોગ બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનમાં વધારો કરશે.
cવપરાયેલ નમૂનાની માત્રા વાસ્તવિક પરિસ્થિતિ અનુસાર ગોઠવી શકાય છે.ક્રૂડ લિસ્ડ નમૂનાની એક પ્રતિક્રિયામાં વપરાતી રકમને પ્રતિક્રિયાના કુલ જથ્થાના 2% - 20% વચ્ચે ગોઠવી શકાય છે.વધુ પડતા નમૂનાઓનો ઉપયોગ એમ્પ્લીફિકેશન નિષ્ફળતાનું કારણ બની શકે છે.
પ્રતિક્રિયા કાર્યક્રમ
| પગલાં | તાપમાન | સમય |
| પ્રારંભિક વિકૃતિકરણ | 98℃ | 5 મિનિટ |
| વિકૃતિકરણ | 95℃ | 10 સે |
| એનેલીંગ | 58 ~ 72℃ | 15 સે |
| વિસ્તરણ | 72℃ | 30 સે |
| અંતિમ વિસ્તરણ | 72℃ | 5 મિનિટ |
aપ્રારંભિક ડિનેચ્યુરેશન (98℃, 5 મિનિટ) છોડના પેશીઓના લિસિસને પ્રોત્સાહન આપે છે, જેનોમિક ડીએનએ મુક્ત કરે છે જેનો ઉપયોગ પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન માટે થઈ શકે છે.સમય ઓછો કરશો નહીં અથવા તાપમાનમાં ઘટાડો કરશો નહીં.
bતેને પ્રાઈમર Tm મૂલ્યની બરાબર અથવા Tm મૂલ્ય કરતાં 2 ~ 4℃ વધુ સેટ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.આ ઉત્પાદનમાં વપરાતું ડાયરેક્ટ એમ્પ્લીફિકેશન ડીએનએ પોલિમરેઝ પરંપરાગત ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝથી અલગ છે, અને પ્રતિક્રિયા એનિલિંગ તાપમાન માટે વિશેષ આવશ્યકતાઓ ધરાવે છે; ઉચ્ચ એનિલિંગ તાપમાનનો ઉપયોગ બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનને અસરકારક રીતે ઘટાડી શકે છે અને એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતામાં સુધારો કરી શકે છે.જટિલ નમૂનાઓ માટે, એનિલિંગ તાપમાનને સમાયોજિત કરીને અને વિસ્તરણ સમયને લંબાવીને કાર્યક્ષમ એમ્પ્લીફિકેશન પ્રાપ્ત કરી શકાય છે.
cજો એમ્પ્લીફિકેશન પ્રોડક્ટની લંબાઈ ≤1 kb હોય, તો એક્સ્ટેંશન સમય 30 સેકન્ડ/kb પર સેટ કરવામાં આવે છે;જો એમ્પ્લીફિકેશન પ્રોડક્ટની લંબાઈ >1 kb હોય, તો એક્સ્ટેંશન સમય 60 સેકન્ડ/kb પર સેટ કરવામાં આવે છે.
ડી.જટિલ નમૂનાઓ અથવા ઓછી એમ્પ્લીફિકેશન યીલ્ડવાળા નમૂનાઓ માટે, ચક્રની સંખ્યાને યોગ્ય રીતે 40 -50 ચક્ર સુધી વધારી શકાય છે.
અરજીઓ
તે છોડના પેશીઓના સીધા એમ્પ્લીફિકેશન અને છોડના નમૂનાઓની ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સ્ક્રીનીંગ માટે લાગુ પડે છે જેમાં પોલિસેકરાઇડ્સ અને પોલિફીનોલ્સ શામેલ નથી.
નોંધો
માત્ર સંશોધન માટે ઉપયોગ.ડાયગ્નોસ્ટિક પ્રક્રિયાઓમાં ઉપયોગ માટે નથી.
1. ક્રૂડ પ્લાન્ટ એમ્પ્લીફિકેશન અથવા ડાયરેક્ટ એમ્પ્લીફિકેશન માટે, સિસ્ટમ, પ્રાઇમર્સ અને ઓપરેશન્સ યોગ્ય છે તેની ખાતરી કરવા પ્રયોગ શરૂ કરતા પહેલા સકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે શુદ્ધ જીનોમિક ડીએનએનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.
2. આ કીટમાં વપરાયેલ ડાયરેક્ટ એમ્પ્લીફિકેશન ડીએનએ પોલિમરેઝ મજબૂત પ્રૂફરીડિંગ પ્રવૃત્તિ ધરાવે છે.જો ટીએ ક્લોનિંગ કરવાની જરૂર હોય, તો એડિનિન ઉમેરતા પહેલા ડીએનએને શુદ્ધ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.
3. પ્રાઈમર ડિઝાઇન માર્ગદર્શન:
aએવી ભલામણ કરવામાં આવે છે કે પ્રાઈમરના 3′ છેડે છેલ્લો આધાર G અથવા C હોવો જોઈએ.
bપ્રાઈમરના 3′ છેડે છેલ્લા 8 પાયામાં સળંગ મેળ ખાતો ટાળવો જોઈએ.cપ્રાઈમરના 3′ છેડે હેરપિન સ્ટ્રક્ચર્સ ટાળો.
ડી.ફોરવર્ડ પ્રાઈમર અને રિવર્સ પ્રાઈમરના Tm મૂલ્યમાં તફાવત 1℃ કરતાં વધુ ન હોવો જોઈએ અને Tm મૂલ્ય 60 ~ 72℃ (Tm મૂલ્યની ગણતરી કરવા માટે પ્રાઈમર પ્રીમિયર 5 ની ભલામણ કરવામાં આવે છે) પર એડજસ્ટ થવી જોઈએ.
ઇ.પ્રાઈમર Tm મૂલ્યની ગણતરી કરતી વખતે વધારાના વધારાના પ્રાઈમર સિક્વન્સ કે જે ટેમ્પલેટ સાથે મેળ ખાતી નથી, તેનો સમાવેશ કરવો જોઈએ નહીં.
fએવી ભલામણ કરવામાં આવે છે કે પ્રાઈમરની GC સામગ્રી 40% -60% હોવી જોઈએ.
gપ્રાઈમરમાં A, G, C અને T નું એકંદર વિતરણ શક્ય એટલું સમાન હોવું જોઈએ.ઉચ્ચ GC અથવા AT સામગ્રીવાળા પ્રદેશોનો ઉપયોગ કરવાનું ટાળો.
hપ્રાઈમરની અંદર અથવા બે પ્રાઈમર વચ્ચે 5 કે તેથી વધુ પાયાના પૂરક ક્રમની હાજરી ટાળો અને બે પ્રાઈમરના 3′ છેડે 3 કે તેથી વધુ પાયાના પૂરક ક્રમની હાજરી ટાળો.
iબિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનને રોકવા માટે પ્રાઈમરની વિશિષ્ટતા તપાસવા માટે NCBI BLAST ફંક્શનનો ઉપયોગ કરો.
