RTL રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ
RTL રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ એ RNA ટેમ્પલેટ-આશ્રિત DNA પોલિમરેઝ છે જેમાં 3'→5' એક્સોનોક્લીઝ પ્રવૃત્તિનો અભાવ છે અને તેમાં RNase H પ્રવૃત્તિ છે.આ એન્ઝાઇમ ડીએનએના પૂરક સ્ટ્રાન્ડને સંશ્લેષણ કરવા માટે નમૂના તરીકે આરએનએનો ઉપયોગ કરી શકે છે, જે ફર્સ્ટ-સ્ટ્રૅન્ડ સીડીએનએ સંશ્લેષણ પર લાગુ કરી શકાય છે, ખાસ કરીને આરટી-એલએએમપી (લૂપ-મીડિયેટેડ આઇસોથર્મલ એમ્પ્લીફિકેશન) માટે.RTL રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેજ 1.0 ની સરખામણીમાં, સંવેદનશીલતા નોંધપાત્ર રીતે સુધરી છે, થર્મલ સ્થિરતા વધુ મજબૂત છે, અને 65°C પર પ્રતિક્રિયા વધુ સ્થિર છે.RTL રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ (ગ્લિસરોલ ફ્રી) નો ઉપયોગ લાયોફિલાઇઝ્ડ તૈયારીઓ, લ્યોફિલાઇઝ્ડ RT-LAMP રીએજન્ટ્સ વગેરે તૈયાર કરવા માટે થઈ શકે છે.
એકમ વ્યાખ્યા
ટેમ્પલેટ-પ્રાઈમર તરીકે પોલી(A)•ઓલિગો(dT)25 નો ઉપયોગ કરીને 50°C પર 20 મિનિટમાં એક એકમ 1 nmol dTTP ને એસિડ-પ્રિસિપિટેબલ સામગ્રીમાં સમાવિષ્ટ કરે છે.
ઘટકો
| ઘટક | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ (ગ્લિસરોલ-ફ્રી) (15U/μL) | 0.1 એમએલ | 1 એમએલ | 10 એમએલ |
| 10×HC RTL બફર | 1.5 એમએલ | 4×1.5 એમએલ | 5×10 એમએલ |
| MgSO4 (100mm) | 1.5 એમએલ | 2×1.5 એમએલ | 3×10 એમએલ |
સંગ્રહ સ્થિતિ
0°C થી નીચે પરિવહન અને -25°C~-15°C પર સંગ્રહિત કરવું.
ગુણવત્તા નિયંત્રણ
- ની શેષ પ્રવૃત્તિEndonuclease:1 μg λDNA અને RTL2.0 ના 15 એકમો ધરાવતી 50 μL પ્રતિક્રિયા 37 ℃ પર 16 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવે છે, જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નકારાત્મક નિયંત્રણની સમાન પેટર્ન દર્શાવે છે.
- ની શેષ પ્રવૃત્તિએક્સોનોક્લીઝ:1 μg હિન્દ Ⅲ ડાયજેસ્ટેડ λDNA અને RTL2.0 ના 15 એકમો ધરાવતી 50 μL પ્રતિક્રિયા 37 ℃ પર 16 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવે છે જે જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નકારાત્મક નિયંત્રણ જેવી જ પેટર્ન દર્શાવે છે.
- ની શેષ પ્રવૃત્તિનિકાસે:50 μL પ્રતિક્રિયા જેમાં 1 μg સુપરકોઇલ્ડ pBR322 અને RTL2.0 ના 15 એકમો 37°C તાપમાને 4 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવે છે તે જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નકારાત્મક નિયંત્રણની સમાન પેટર્ન દર્શાવે છે.
- ની શેષ પ્રવૃત્તિRNase:10 μL પ્રતિક્રિયા જેમાં 0.48 μg MS2 RNA અને RTL2.0 ના 15 એકમો 37°C તાપમાને 4 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવે છે તે જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા નકારાત્મક નિયંત્રણની સમાન પેટર્ન દર્શાવે છે.
- ઇ. કોલી gડીએનએ:સાથે માપવામાં આવે છેઇ.કોલીચોક્કસ એચસીડી ડિટેક્શન કિટ્સ，RTL2.0 ના 15 એકમોમાં 1 કરતા ઓછા હોય છેઇ. કોલીજીનોમ
પ્રતિક્રિયા સેટઅપ
cDNA સિન્થેસિસ પ્રોટોકોલ
| ઘટકો | વોલ્યુમ |
| ઢાંચો RNA a | વૈકલ્પિક |
| ઓલિગો(dT) 18~25(50uM) અથવા રેન્ડમ પ્રાઈમર મિક્સ(60uM) | 2 μL |
| dNTP મિક્સ (10mM દરેક) | 1 μL |
| RNase અવરોધક (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL બફર | 2 μL |
| ન્યુક્લિઝ-મુક્ત પાણી | 20 μL સુધી |
નોંધો:
1) કુલ RNA ની ભલામણ કરેલ માત્રા 1ng~1μg છે
2) mRNA ની ભલામણ કરેલ માત્રા 50ng~100ng હતી
થર્મો-નિયમિત માટે સાયકલિંગ શરતો પ્રતિક્રિયા:
| તાપમાન (°C) | સમય |
| 25 °સેa | 5 મિનિટ |
| 55 °સે | 10 મિનિટb |
| 80 °સે | 10 મિનિટ |
નોંધો:
1) જો રેન્ડમ પ્રાઈમર મિક્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, તો 25°C પર ઇન્ક્યુબેશન સ્ટેપ.
2) જો ટાર્ગેટ પ્રાઈમર મિક્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવે, તો 10~30 મિનિટ માટે 55°C પર ઇન્ક્યુબેશન સ્ટેપ.
RT-LAMP પ્રોટોકોલ
| ઘટકો | વોલ્યુમ | અંતિમ એકાગ્રતા |
| ઢાંચો RNA | વૈકલ્પિક | ≥10 નકલો |
| dNTP મિક્સ (10mm) | 3.5 μL | 1.4 એમએમ |
| FIP/BIP પ્રાઈમર્સ (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 પ્રાઈમર્સ (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB પ્રાઇમર્સ (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase અવરોધક (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/પ્રતિક્રિયા |
| RTL રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેજ 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 યુ/પ્રતિક્રિયા |
| Bst V2 DNA પોલિમરેઝ (8U/μL) | 1 μL | 8 U/પ્રતિક્રિયા |
| MgSO4 (100mm) | 1.5 μL | 6 એમએમ (કુલ 8 એમએમ) |
| 10×HC RTL બફર (અથવા 10×HC Bst V2 બફર) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| ન્યુક્લિઝ-મુક્ત પાણી | 25 μL સુધી | - |
નોંધો:
1) વમળ દ્વારા મિક્સ કરો અને સંક્ષિપ્તમાં એકત્રિત કરવા માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો.1 કલાક માટે 65 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર સતત તાપમાનનું સેવન.
2) બે બફર્સ ઇન્ટરઓપરેબલ છે અને સમાન રચના ધરાવે છે.
નોંધો
1. જ્યારે -20 °C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવે ત્યારે આ ઉત્પાદન સફેદ ઘન બનાવશે.તેને -20 ડિગ્રી સેલ્સિયસથી બહાર કાઢો અને લગભગ 10 મિનિટ માટે બરફ પર મૂકો.ઓગળ્યા પછી, તેનો ઉપયોગ હલાવીને અને મિશ્રણ દ્વારા કરી શકાય છે.
2. cDNA ઉત્પાદન -20°C અથવા -80°C પર સંગ્રહિત કરી શકાય છે અથવા PCR પ્રતિક્રિયા માટે તરત જ ઉપયોગમાં લઇ શકાય છે.
3.RNase દૂષણને રોકવા માટે, કૃપા કરીને પ્રાયોગિક વિસ્તારને સ્વચ્છ રાખો, અને ઓપરેશન દરમિયાન સ્વચ્છ મોજા અને માસ્ક પહેરો.
